Положительный результат РИБТ наблюдается у больных с тро­пическими трепонематозами (пинта, беджель). Иногда РИБТ дает ложноположительный результат при саркоидозе, эритематозе, ту­беркулезе, циррозе печени, атеросклерозе и др. С возрастом пациен­тов число ложноположительных результатов РИБТ увеличивается.
Упрощенная методика РИБТ (Методика разработана проф. Н. М. Овчинниковым.). Кровь для получения сы­воротки берут из вены стерильно в сухую чистую и простерилизованную посуду. Больной перед взятием крови не должен принимать никаких лекарственных средств, которые могли бы оказать вредное влияние на подвижность трепонем; в частности, необходимо пре­кратить введение дюрантных препаратов пенициллина на срок воз­можной задержки его в организме. Инактивация сыворотки произ­водится в течение 30 мин при температуре 56 °С, а если сыворотка была инактивирована накануне, то в день постановки реакции ее прогревают в течение 10 мин. Никаких консервантов в сыворотку не добавляют. При необходимости длительного хранения сыворотку можно заморозить при –20 °С. Сыворотки, высушенные на воща­ной бумаге (с добавлением свежеприготовленного 40 % пищевого сахара по 3 капли на каждые 0,5 мл сыворотки), можно в отдель­ных случаях применять для исследования. Следует, однако, учиты­вать, что титр иммобилизинов снижается при высушивании сыво­ротки подобно реагинам и при невысоких титрах снижение может быть значительным. Поэтому не следует широко пользоваться в РИБТ высушенными сыворотками.
Срок годности для исследования высушенной сыворотки 5 дней с момента приготовления в южных районах нашей страны или в жаркое время года и 10 дней – в остальных регионах. Сыворотка нативная, хранящаяся в холодильнике при температуре +3…+5°С, также теряет свою активность.
В качестве антигена применяют взвесь бледных трепонем из ран­него орхита кролика, зараженного сифилисом, обычно штаммом Никольса. Для заражения следует брать совершенно здоровых кро­ликов-самцов массой 2-2,5 кг, предварительно исследовав у них кровь на реакцию Вассермана. Отбирают только кроликов с отрица­тельными результатами серологических реакций. Заражение произ­водят внутрь яичка взвесью трепонем в количестве не менее 50-60 в поле зрения в объеме 0,50-0,75 мл. Непосредственно после зараже­ния кролику вводят внутримышечно 20 мг кортизона, а в последу­ющие дни – по 10 мг ежедневно. Рекомендуемое рядом исследова­телей одновременное рентгеновское облучение кроликов трудно для выполнения и не дает существенных преимуществ.
Для удаления яичка (при 6-8-дневном орхите) кролика привя­зывают к станку, обескровливают сердечной пункцией (некоторые предпочитают обескровливать через сонную артерию). Затем забива­ют кролика воздушной эмболией (введение 15 см3 воздуха в крае­вую вену уха). Яички выводят в мошонку путем поглаживания ла­донью по животу кролика сверху вниз. Поверхность кожи мошон­ки, предварительно немного подстриженной ножницами, смазыва­ют спиртом, поджигают, тут же тушат и опять поджигают. Этим достигаются освобождение кожи от шерсти и одновременно дезин­фекция кожи. После этого мошонку покрывают резиновой стериль­ной салфеткой с разрезом, через который выводят наружу яичко. Оператор фиксирует яичко одной рукой, а другой рукой делает скальпелем небольшой поперечный разрез кожи мошонки. Ножни­цами отрезают яичко от подлежащих тканей и помещают его в стерильную чашку Петри. Такого же рода манипуляцию проделыва­ют и с другим яичком. Далее ножницами удаляют придаток, осво­бождают яичко от жира и разрезают его на 10-15 кусочков. Готовят препарат с каплей изотонического раствора натрия хлорида и опре­деляют под микроскопом в темном поле наличие трепонем и их число. Все кусочки помещают в стерильную колбу объемом 50-75 мл, в которую уже налита среда (сыворотка кролика, разведенная 0,83 % стерильным раствором натрия хлорида, в количестве 10-14 мл на яичко). Колбу ставят в аппарат для встряхивания на 20-30 мин. После этого все содержимое выливают в большую стерильную центрифужную пробирку и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин для удаления плотных кусочков тканей. Затем надосадочную жидкость сливают и готовят препараты для микроскопии. Определяют число трепонем в темном поле зрения (окуляр 10, объек­тив 40). Если число трепонем большое, то взвесь следует развести, чтобы было по 10-15 трепонем в поле зрения, так как при большем их числе трудно подсчитывать иммобилизованные трепонемы.
Обычно в центрифужной пробирке над осадком оставляют не­которое количество жидкости и дают возможность немного ей постоять. Жидкостью, содержащей большое число трепонем, заража­ют кроликов для следующей постановки реакции. При каждой по­становке следует одновременно производить и заражение. Заражен­ных кроликов содержат в клетках в проветриваемом помещении при температуре +18…20°С. Пища кроликов должна содержать зна­чительное количество витаминов.
Для сохранения трепонем жизнеспособными предложено боль­шое количество различных сред (Овчинников Н. М., 1961).
Первоначально среда Нельсона была очень сложна. Затем Нельсон значительно упростил ее, но она все еще сложна. A. Bellone и М. Bonelli (1957) в качестве среды для сохранения трепонем применя­ют разведенную изотоническим раствором натрия хлорида сыворот­ку человека (2:1), а К. Meinike и К. Lagel (1959) – сыворотку кролика (2:1 или 1:1). Следует отметить, что трепонемы, взвешен­ные в одном изотоническом растворе натрия хлорида и особенно вместе с сывороткой больного и комплементом в небольшой дозе, выживают, судя по контрольным исследованиям, и без какой-либо среды, однако сроки их выживания значительно короче, подвиж­ность менее активна, и наблюдается значительное количество со­мнительных результатов.
Н.М. Овчинников (1961, 1962) предложил для РИБТ простую среду. Готовят 0,2% раствор пищевого желатина на 0,83 % растворе натрия хлорида. Раствор стерилизуют автоклавированием при тем­пературе 110°С в течение 10 мин, после чего добавляют стрептоми­цина сульфат из расчета 1:10000. Среда для опыта состоит из сыво­ротки кролика, разведенной 1:2 изотоническим раствором натрия хлорида, желатина и раствора человеческого альбумина. Альбумин готовят на изотоническом растворе натрия хлорида, стерилизуют фильтрацией через бактериальный фильтр (пригоден только сухой альбумин, лиофильно высушенный); каждый раз при употребле­нии новой серии следует испытать, параллельно со старой, новую серию. Весь запас ингредиентов хранится в обычном рефрижерато­ре.
На 10 сывороток требуется 1,2 мл 0,2 % раствора желатина, 2,8 мл 5 % раствора альбумина и 1,6 мл взвеси трепонем. Вымывание трепонем обычно производят разведенной кроличьей сывороткой, но можно с самого начала использовать указанную среду сохране­ния.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113